Analyses génétiques par PCR

La Polymerase Chain Reaction (PCR) est une méthode basée sur la multiplication sélective de séquences d' ADN cibles.C'est un procédé d’amplification moléculaire qui mime le processus naturel de synthèse de l’ADN.

Cette technique analytique permet de détecter des séquences d’ADN spécifiques présentes dans un produit. C'est une technique appliquée pour pour la détection d'OGM, mais aussi pour la détection d'allergènes ou l'identification d'espèces.

Les séquences cibles peuvent être des promoteurs ou terminateurs d'une construction génétique, dans le cadre d'un screening, ou bien des séquences spécifiques.

La PCR en temps réel

La PCR en temps réel combine l’amplification avec la détection et la quantification d’un signal fluorescent.

Dans le cadre des OGM, la quantification est effectuée par le ratio ADN OGM / ADN total de l’espèce cible.

Etapes de la PCR

Etape 1 : Dénaturation

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pendant la dénaturation, réalisée à une température de 95°C, l’ADN double-brin est séparé en ses deux brins d’ADN constitutifs.

Etape 2 : Hybridation

Lors de l’étape d’hybridation, un oligonucléotide (la sonde) s’apparie à la séquence d’ADN qui lui est complémentaire. Deux molécules spécifiques, le rapporteur et le quencher bordent les extrémités de cet oligonucléotide. Le quencher piège la fluorescence du rapporteur tant que l’un et l’autre sont liés à la sonde non dégradée. Pendant l’hybridation, la sonde s’apparie à l’ADN de l’échantillon à une température de 70°C si l’échantillon contient la séquence cible recherchée.

Etape 3 : Polymérisation

Un deuxième oligonucléotide, l’amorce, s’hybride en amont, à quelques paires de bases de distance de la sonde. Une enzyme, l’ADN polymérase initie à 60°C la synthèse de l’ADN à partir de l’amorce en direction de la sonde.

Etape 4 : Emission de fluorescence

Durant cette dernière étape, l’enzyme dégrade la sonde et poursuit la synthèse du second brin d’ADN. Il en résulte que le rapporteur n’est plus localisé à proximité du quencher. La fluorescence émise par le rapporteur n’est alors plus piégée. Le signal fluorescent peut être quantifié.

Les étapes 1 à 4 sont répétées de 35 à 50 fois. À la fin de ce processus, la quantité d’ADN génétiquement modifiée est déterminée par la mesure de la fluorescence. Ce système est très sensible et permet souvent de détecter moins de dix copies d’ADN génétiquement modifiées.