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Compte-rendu de la conférence Internationale ISOPOL XIII

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Dossier : Listeria

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Compte-rendu de la conférence Internationale ISOPOL XIII : XIII Symposium International sur les problèmes de listériose, 28 juin - 2 juillet 1998 - Halifax, Nouvelle-Écosse, Canada


La conférence internationale ISOPOL XIII a traité de Listeria et des problèmes de listériose et réuni les plus grands spécialistes mondiaux de ce domaine. 

Les thèmes abordés sont les suivants : 
Introduction 
1. Développements récents en microbiologie alimentaire 
2. Réglementation vis-à-vis de Listeria monocytogenes dans les aliments 
3. Epidémiologie 
4. Typage et caractérisation des souches de Listeria monocytogenes : Etude collaborative OMS 
5. Virulence de Listeria monocytogenes 

Introduction 
Historiquement, Listeria monocytogenes a été décrite pour la première fois en 1924. A l'époque, la bactérie a été appeléeBacterium monocytogenes. En 1925, elle a été appelée Listerella hepatolitica. En 1936, Burn suggère que la maladie est liée à la consommation d'aliments contaminés. Gray a décrit les premières infections à Listeria monocytogenes. La première épidémie de listériose a été décrite en 1966 en Allemagne. Les différentes espèces de Listeria ont bien été caractérisées vers 1980-1981, par la méthode d'hybridation ADN (J. Rocourt). Ensuite, un certain nombre d'épidémies liées à la consommation de divers aliments (fromage, charcuterie, viande) ont été décrites. 

1. Développements récents en microbiologie alimentaire 
Les recherches actuelles en microbiologie alimentaire, portent sur trois domaines principaux : 

- méthodes de détection et de caractérisation de Listeria monocytogenes dans les aliments 
- méthodes d'analyse des risques 
- étude des mécanismes physiologiques liés à un stress 

1.1. Méthodes rapides de détection et de caractérisation de Listeria monocytogenes dans les aliments. 
Il est à noter que la population à risque (vis-à-vis de Listeria monocytogenes) est en augmentation. En effet, la proportion de personnes âgées et immunodéprimées est en constante augmentation. 
Parmi les méthodes rapides, nous pouvons citer : 

1. les méthodes basées sur les acides nucléiques : par exemple la PCR : sensibilité : 1 UFC/g 
2. les méthodes basées sur les réactions antigènes-anticorps 
3. les méthodes basées sur les bactériophages. 

Toutes ces méthodes nécessitent une phase d'enrichissement. Cet enrichissement peut être effectué : 
- en bouillon classique. Il existe des problèmes de détection de L.monocytogenes et de L.ivanovii en présence de L.innocua. Cela pourrait être dû aux concentrations d'acriflavine et d'acide nalidixique trop élevées pour permettre la croissance deL.monocytogenes (plus sensible que L.innocua). 
- par concentration immuno-magnétique, 
- par centrifugation suivi d'une détection par PCR : cette technique est utilisée avec succès pour la détection de E.coli..

Les défis pour le futur :

Améliorer les milieux d'enrichissement : afin, par exemple, de pouvoir détecter L.monocytogenes en présence de L.innocua.

Développer des méthodes permettant de dénombrer la bactérie dans les aliments. 
Développer les techniques d'identification de l'ADN.

NB : La technique PCR permet de détecter des cellules de L.monocytogenes qui ne se développent pas en bouillon. 
La méthode classique d'identification de l'espèce Listeria monocytogenes est basée sur la fermentation de deux sucres (xylose et rhamnose) et sur l'hémolyse. La plupart des souches de Listeria monocytogenes sont catalase positive (C+), fermentent le rhamnose (R+) mais ne fermentent pas le xylose (X-) et présentent une activité hémolytique (H+). Cependant il existe des souches de Listeria monocytogenes qui, soit ne sont pas hémolytiques, soit sont catalase négative, ou soit ne fermentent pas le rhamnose. Pour identifier ces souches atypiques, des méthodes existent. Ces méthodes peuvent être réalisées par une réaction antigènes-anticorps (ex: VIDAS), par une hybridation ADN-ADN (Accuprobe), par ribotypage ou par électrophorèse " multilocus ".

La virulence de souches atypiques de Listeria monocytogenes a été testée sur des souris. La moitié de dose létale (DL50) pour les souches non hémolytiques est supérieure à 108 UFC. La DL50 pour les souches qui ne fermentent pas le rhamnose est 102 UFC. La DL50 est voisine de 104-105 UFC pour les souches typiques de Listeria monocytogenes.

Remarque 
Lorsque l'on utilise la méthode classique d'identification des espèces de Listeria, les souches de Listeria monocytogenes non hémolytique sont identifiées comme étant Listeria innocua. Etant donné que la virulence de ces souches est nettement moins importante que celle des souches hémolytiques, cette erreur d'identification de l'espèce n'est pas très grave. Par contre, pour les souches qui ne fermentent pas le rhamnose, la virulence est importante, et il est important de noter que ce test peut être négatif pour certaines souches de Listeria monocytogenes.

1.2. Méthodes d'analyse des risques 
L'analyse des risques se décompose en trois parties : 
- l'évaluation des risques : il existe une commission internationale sur l'évaluation des risques. Cette commission est composée d'industriels et de scientifiques.

- la gestion du risque,
- la communication des risques

L'évaluation des risques pour Listeria monocytogenes doit prendre en compte l'environnement du micro-organisme et sa capacité à se développer dans l'aliment concerné. Afin d'estimer la fréquence d'exposition par personne et par an, des données microbiologiques sur les aliments sont indispensables. Il est intéressant de connaître, pour chaque type d'aliment, le pourcentage de produits contaminés et les niveaux de contamination.
Exemple : Pourcentage de produits carnés contaminés en fonction du niveau de contamination en Listeria monocytogenes.

Nombre de L.monocytogenes

10 UFC/g

103 UFC/g

105 UFC/g

>106 UFC/g
Pourcentage d'échantillons positifs

36

19

4

0,8

UFC : Unités formant des colonies

Etablissement d'un modèle dose-réponse : actuellement la dose minimale entraînant des symptômes de listériose n'est pas connue. Sur des souris, il semble que la dose minimale induisant une réaction est de 105 UFC par ingestion et de 101 UFC par injection. Sur des souris protégées, ces doses seraient multipliées par 10.

Le risque est égal au produit de l'exposition et de la dose-réponse : Risque = exposition x dose-réponse

La probabilité de développer une infection est : Pinf = 1-e-risque

Remarque : La législation de certains pays impose une absence de Listeria monocytogenes dans 25 ou 50 g (Zéro tolérance). Selon Notermans, ce seuil est économiquement impossible à atteindre sur certains aliments, mais ce sont les industriels qui doivent s'impliquer pour que la législation soit révisée.

La démarche de modélisation de la croissance est la suivante : 
1. définition des facteurs pris en compte et de la gamme d'étude 
2. planification de l'expérimentation 
3. collecte de données expérimentales 
4. modélisation proprement dite : ajustement d'équations mathématiques aux données expérimentales.

Il existe trois classes de modèles : 
- Les modèles primaires : ce sont des équations qui décrivent les courbes de croissance des micro-organismes. Les principaux modèles utilisés sont ceux de Gompertz, Baranyi et Monod. 
- Les modèles secondaires : ce sont des équations qui relient les paramètres caractéristiques de la croissance (phase de latence et vitesse de croissance exponentielle) aux facteurs étudiés (températures, pH, aw, etc.). Les modèles les plus développés sont les modèles polynomiaux (modèle de Buchanan), les modèles en racine carrée (modèle de Zwietering) et les modèles dérivés de l'équation d'Arrhenius (modèle de Davey). 
- Les modèles tertiaires : ce sont des logiciels dans lesquels sont incorporés un certain nombre de modèles secondaires. Les deux modèles tertiaires les plus développés sont le " Food Micromodel " et le " Pathogen Modelling Program ".

5. validation et amélioration des modèles établis.

Les applications de la modélisation de la croissance des germes pathogènes sont nombreuses : 
- Estimation des risques 
- Identification des points critiques dans la mise en place d'HACCP 
- Aide à la formulation de nouveaux produits 
- Evaluation de la fréquence de produits non conformes

Les critiques : il existe actuellement des problèmes pour modéliser la phase de latence, car on ne connaît pas, réellement, les événements physiologiques qui se produisent pendant cette phase. Il est donc nécessaire d'avoir des modèles sécuritaires (" fail-safe models "), pour limiter les risques d'erreur dus à une évaluation trop courte de la durée de la phase de latence.

Les modèles descriptifs n'ont une utilité que limitée dans la prévision de la croissance.
Actuellement, les modèles de croissance intègrent un terme décrivant la croissance et un terme décrivant la décroissance. Ainsi, la totalité de la croissance peut être décrite. La phase de latence est alors considérée comme une phase d'adaptation des micro-organismes à leur environnement. Dans certains modèles, les cellules sont considérées individuellement.

Pour l'avenir, il semble que les modèles mécanistiques qui prennent en compte la physiologie des cellules permettraient de répondre aux limitations actuelles.

1.3. Etude des mécanismes physiologiques liés à un stress

Les cellules de Listeria monocytogenes sont généralement bien adaptées aux stress liés aux procédés de fabrication (pH, température, aw). Actuellement, on connaît des protéines induites par le froid. Douze protéines sont induites lorsque les cellules subissent un choc de température (passage de 37°C à 5°C). Quatre protéines sont induites lorsque les cellules sont mises en culture à 5°C. On sait aussi que trois gènes différents s'expriment.

Adaptation aux températures basses : au cours de la croissance à basse température (4°C), on observe une augmentation de la phase de latence et la croissance est réduite. La fluidité de la membrane est différente à 4°C et à 37°C. Le synthèse de flagelles est observée à faible température (10°C). Les aliments contenant des peptides semblent améliorer la croissance deListeria monocytogenes à basse température.

Adaptation à l'aw : les cellules de Listeria monocytogenes sont capables de s'adapter dans des milieu ayant une osmolarité élevée. On observe une accumulation d'ion potassium (K+) et de tréhalose dans la cellule. La glycine-bétaïne protège les cellules dans les milieux à osmolarité élevée. Ce composé est retrouvé à la surface des cellules.

Protection croisée : La glycine-bétaïne a aussi un effet cryoprotecteur sur les cellules. Un choc osmotique augmente la thermorésistance des cellules.

Réponse à un stress acide : un stress à pH légèrement acide sur des cellules en phase de croissance exponentielle induit une résistance à pH faible. Les cellules en phase de croissance stationnaire sont déjà naturellement plus résistantes aux faibles pH que les cellules en phase de croissance exponentielle. De plus, les pH acides permettent de sélectionner des cellules qui tolèrent la présence d'acide et qui sont plus virulentes que des cellules sensibles à l'acide.

Des changements de morphologie sont également observés. Des cellules de Listeria monocytogenes, cultivées en bouillon TSB additionné de 9% de NaCl, sont plus longue que des cellules incubées en bouillon TSB sans addition de sel. On peut aussi observer la formation de filaments de grande taille (largeur du champs du microscope).

2. Réglementation vis-à-vis de Listeria monocytogenes dans les aliments 

La réglementation alimentaire vis-à-vis de Listeria monocytogenes n'est pas identique dans tous les pays. Lors de cette conférence, différentes réglementations ont été présentées. 
Canada

Les aliments sont classés en fonction du risque lié à chaque aliment. Les trois classes d'aliments sont les suivantes :
- Aliments prêt-à-l'emploi qui ont été liés à une infection par Listeria monocytogenes pour lesquels la réglementation impose : Absence dans 50 g.- Aliments prêt-à-l'emploi dans lesquels Listeria monocytogenes peut se développer et qui ont une durée de vie supérieure à 10 jours à 4°C, pour lesquels la réglementation impose une absence dans 25 g.- Aliments prêt-à-l'emploi dans lesquels Listeria monocytogenes ne peut pas se développer ou qui ont une durée de vie inférieure à 10 jours à 4°C, pour lesquels la réglementation tolère moins de 102 UFC/g. 
Etats-Unis

La réglementation actuelle impose une absence dans 50 g dans les aliments. Les industriels souhaitent que cette réglementation soit révisée car elle est impossible à respecter pour certains aliments. L'utilisation de l'analyse des risques, l'information des consommateurs à risque et la surveillance de la contamination de l'environnement de production sont des paramètres qui devraient permettre de fixer une tolérance à moins de 102 UFC/g sur certains aliments. 
Amérique du sud

La réglementation impose une absence dans 25 g. 
Europe

Une tolérance à moins de 102 UFC/g à la DLC est fixée pour certains aliments. Il est actuellement admis que pour certains aliments, il est impossible de garantir l'absence de Listeria monocytogenes. La préoccupation actuelle est de répondre à la question " comment maîtriser la croissance de Listeria monocytogenes dans les aliments " plutôt qu'à la question " comment éviter la présence de Listeria monocytogenes dans les aliments ".
Au niveau international

Il est envisagé de séparer les aliments en classe et de fixer une tolérance à moins de 102 UFC/g pour certains aliments. Pour cela, la réglementation doit se baser sur des données scientifiques et sur l'analyse des risques. L'Allemagne doit rédiger un texte qui sera présenté lors de la prochaine réunion du Codex Alimentarius.

3. Epidémiologie 

Dans les pays industrialisés, il est à noter un forte diminution de l'incidence de la listériose au cours des dix dernières années. Aux Etats-Unis, le nombre de cas de listériose est passé de 7,7 cas par million d'habitants en 1990 à 4,7 cas par million d'habitants en 1997. En Scandinavie, le nombre de cas de listériose est de 5,1 cas par million d'habitants en 1997 (de 3 cas en Suède à 6,3 cas au Danemark et en Finlande). Au Royaume Uni, le nombre de cas de listériose est de 2,6 cas par million d'habitants en 1996. En France, le nombre de cas de listériose est passé de 20 cas par million d'habitants en 1986 à 4 cas par million d'habitants en 1996.

Dans le même temps, le nombre de cas périnataux a fortement diminué. En 1986, en France, 50 % des cas de listériose étaient des femmes enceintes, en 1996, la proportion est passée à 25 %. Aux Etats-Unis, le nombre de cas de listériose périnatale est passé de 18 cas par million à 4,5 cas par million entre 1989 et 1997. Au Royaume Uni, le nombre de cas de listériose périnatale est passé de 100 cas par million à 17 cas par million entre 1990 et 1996.

La forte diminution de l'incidence de la listériose est liée d'une part à l'amélioration des pratiques de fabrication et d'autre part à la formation et l'information des consommateurs à risques (population âgée et/ou hospitalisée). La législation au niveau alimentaire a également eu une incidence sur la diminution des cas de listériose. Le nombre de cas de listériose atteignant la population normale (sans risque particulier)) est passé de 75 en 1987 à 8 en 1997. Lors des cas sporadiques, c'est surtout une population très sensible qui est touchée (personnes âgées ou fortement immuno-déprimées). En effet, dans ce cas, la contamination en Listeria monocytogenes est faible. Pendant les épidémies, le nombre de cas de listériose chez les femmes enceintes et la population normale augmente de façon significative. Lors d'épidémie, on constate en effet un taux de contamination élevé dans les aliments.

Il semble donc que la population à risque classiquement connue tende à évoluer. Les personnes âgées et les personnes très immuno-déprimées (patients atteint du sida) seraient beaucoup plus sensibles que les femmes enceintes et les nourrissons. Ainsi, la population peut être divisée en trois groupes de risques :

- la population normale, pour laquelle le risque est très faible 
- les femmes enceintes et les nourrissons, pour lesquels le risque est moyen 
- les personnes très âgées ou très immuno-déprimées, pour lesquelles le risque est important.

Incidence de la listériose en fonction de l'âge de la population aux Etats-Unis: 
- plus de 70 ans : 21,6 cas par million 
- de 60 à 69 ans : 10 cas par million 
- moins de 30 ans : moins de 2 cas par million

Remarque
Afin de limiter l'incidence de Listeria monocytogenes, il semble important d'agir à plusieurs niveaux : industriels (pratiques de fabrication), distribution et consommateur (information).Depuis peu, la listériose se manifeste aussi sous forme de gastro-entérite. Ces symptômes sont moins décrits dans la littérature que les autres manifestations de la maladie (méningites, encéphalites, etc.). Les cas de gastro-entérite liés à Listeria monocytogenes ne seraient pas dus uniquement à des cellules du sérotype 4b. En 1998, en Italie, une épidémie de listériose a touché 1594 personnes. Tous les patients étaient atteints de gastro-entérite. Aucun décès n'a été observé. Les cellules appartenaient au sérotype 4. Lors des précédentes épidémies, c'est toujours le sérotype 4b qui a été identifié et la proportion de femmes enceintes atteintes était importante.

4. Typage des souches de Listeria monocytogenes : Etude collaborative OMS 

Cette étude collaborative internationale concerne environ 20 laboratoires. Elle à pour but d'évaluer d'une part les performances plusieurs méthodes de caractérisation de souches et d'autre part d'évaluer la reproductibilité inter-laboratoires de ces méthodes. Pour cela, tous les laboratoires ont travaillé sur les mêmes souches de Listeria monocytogenes. Les méthodes de typages utilisées sont :
- sérotypage
- typage par phage
- REA-DNA
- RFLP (PFGE) 
- RAPD 
Le sérotypage

Pour étudier cette méthode, 81 souches ont été utilisées et 7 laboratoires (dont l'Institut Pasteur et le CNEVA de Paris) ont participé. Les sérum sont soit fabriqués au laboratoire, soit achetés à une firme japonaise. Les souches utilisées sont des souches qui ont déjà été sérotypées.

Les résultats obtenus montrent que les sérum de la firme japonaise sont de bonne qualité et permettent un sérotypage assez correct. Ils peuvent donc être utilisés par des laboratoires qui ne fabriquent pas eux-mêmes les sérum. 
Le typage par phages

Pour cette caractérisation de nouveaux phages ont été utilisés. Les résultats obtenus sont corrects. Les différents essais réalisés dans un laboratoire donne les mêmes résultats, et les essais inter-laboratoires donnent également les mêmes résultats (sauf pour un laboratoire). 
La méthode REA-DNA : Analyse d'ADN par enzymes de restriction.

Cette technique permet, par l'utilisation de quatre enzymes de restriction, d'obtenir un grand nombre de petits fragments d'ADN que l'on sépare sur un gel d'électrophorèse. La méthode nécessite une standardisation pour obtenir des résultats comparables. Cette standardisation concerne la concentration du gel et la technique de l'électrophorèse utilisée. Parmi les problèmes rencontrés, on peut noter les logiciels actuels ne sont pas capables de différencier les divers profils générés dans les différents laboratoires. 
L'analyse par RFLP

Dans cette technique, deux enzymes de restriction sont utilisées. On obtient ainsi de " gros " fragments d'ADN. Pour pouvoir les séparer, une électrophorèse classique ne suffit pas. Il faut réaliser une électrophorèse en champ pulsé (multidirectionnelles), pour que les molécules passent au travers des mailles du gel. Les résultats obtenus entre les différents laboratoire montrent une concordance comprise entre 30 et 75%. De plus, cette technique est limitée car elle a un délai de réponse d'environ 3 jours. La technique REA-DNA a un délai de réponse de 1 jour. Lors de la conférence, un nouveau protocole de RFLP a été proposé. Ce protocole doit permettre de réduire le délai de réponse. 
L'analyse par RAPD

La technique RAPD est une technique PCR d'amplification de l'ADN. L'utilisation de plusieurs amorces (ou " primers ") permet une bonne discrimination des souches. Cependant, des problèmes de reproductibilité inter et intra-laboratoire ont été mis en évidence. Les problèmes de reproductibilité peuvent être dus :
- à la méthode de préparation des échantillons : on peut travailler sur la cellule entière ou sur l'ADN purifié,
- la qualité des amorces utilisées,
- la maîtrise des cycles thermiques,
- les conditions d'électrophorèse : en particulier la lecture des gels d'électrophorèse,
- les témoins (contrôles) utilisés. 
La technique de ribotypage
 
Cette technique est basée sur le même principe que la méthode RFLP, mais c'est l'ARN ribosomal (ARNr) qui est étudié. Les fragments d'ARNr peuvent être séparés directement sur un gel d'électrophorèse. On peut aussi, faire une synthèse d'ADN à partir des fragments d'ARNr et séparer les fragments d'ADN ainsi obtenus. 
Le Riboprinter est un système de ribotypage automatisé.

5. Virulence de Listeria monocytogenes  
La virulence de Listeria monocytogenes est liée à l'expression de protéines particulières qui ont chacune un rôle précis. Ces protéines sont : 
- les internalines : elles ne sont présentent que chez les espèces de Listeria pathogènes (Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii). Il existe deux internalines chez Listeria monocytogenes (Int A et Int B). Ces protéines permettent à la bactérie d'entrée dans les cellules. Selon les cellules, seule l'internaline Int A ou les deux internalines sont nécessaires. Les cellules épithéliales contiennent un récepteur spécifique de l'internaline. 
- la listériolysine O : à l'intérieur des macrophages, les cellules de Listeria monocytogenes sont dans une vacuole (formée lors de l'entrée des bactéries dans la cellules). La listériolysine O a pour principale action la lyse de la vacuole et la libération de la bactéries dans la cellule. 
- la protéine Act A : c'est une protéine de la membrane de bactéries à coloration de Gram positive. Elle permet la polymérisation des filaments d'actine. Les filaments d'actine sont responsables de mouvement de la cellule de Listeria monocytogenes et des cellules animales. La protéine Act A joue donc un rôle important dans le mouvement des cellules. Sans cette protéine, les mouvements de la cellule de Listeria monocytogenes existent toujours mais sont très lents. 
- le système PC-PLC (Phospholipase C-Potential Lysis Cell) : Les cellules de Listeria monocytogenes ont la capacité de lyser les cellules animales. Ce potentiel de lyse appelé PC-PLC (Phospholipase C-Potential Lysis Cell). Dans les cellules deListeria monocytogenes, le PC-PLC existe sous une forme primaire (pro-PC-PLC). La transformation de pro-PC-PLC (non actif) en PC-PLC dépend du pH.

La virulence de Listeria monocytogenes est liée à l'expression de gènes spécifiques codant pour des protéines particulières. Les gènes impliqués dans la virulence de Listeria monocytogenes sont : 
prf A : ce gène n'est pas uniquement responsable de la virulence car on le trouve aussi dans les cellules de Listeria ivanovii(pathogène pour l'animal) et Listeria seeligeri (non pathogène). Ce gène est donc rencontré chez les espèces de Listeriahémolytiques. Chez Listeria monocytogenes ce gène régule la fabrication de l'internaline A 
plc A, hly, mpl, : l'expression de ces trois gènes est contrôlée par le gène prf A 
inl A : ce gène code pour l'internaline A. 
act A et plc B

Selon les conditions de croissance (milieu de culture) les gènes exprimés sont différents. Lorsque les cellules sont mises en culture dans un bouillon BHI, seuls les gènes hly et inl A s'expriment. Dans les cellules, tous les gènes sauf inl A sont exprimés.